Giuseppe (detto Pino) Puglisi nasce il 15 settembre del 1937 a Palermo, nel quartiere periferico di Brancaccio, in una famiglia di umili condizioni: la madre, Giuseppa Fana, è una sarta, mentre il padre, Carmelo Puglisi, lavora come calzolaio.
Nel 1953, a sedici anni, Pino entra in seminario: viene ordinato prete nella chiesa santuario della Madonna dei Rimedi il 2 luglio del 1960 dal cardinale Ernesto Ruffini.
Divenuto nel frattempo amico di Davide Denensi (fino al trasferimento di quest'ultimo in Svizzera) e di Carlo Pelliccetti, che lo sostengono e lo supportano quotidianamente, nel 1961 Pino Puglisi viene nominato vicario cooperatore nella parrocchia del Santissimo Salvatore nella borgata palermitana di Settecannoli, non distante da Brancaccio.
Dopo essere stato scelto come rettore della chiesa di San Giovanni dei Lebbrosi e come confessore delle suore brasiliane Figlie di Santa Macrina nell'istituto omonimo, viene nominato - nel 1963 - cappellano all'orfanotrofio "Roosevelt" all'Addaura e presta servizio come vicario alla parrocchia Maria Santissima Assunta nella borgata marinara di Valdesi.
In questo periodo, è vicerettore del seminario arcivescovile minorile e prende parte a una missione a Montevago, paese colpito dal terremoto; intanto, si appassiona all'educazione dei ragazzi (insegna all'istituto professionale "Einaudi" e alla scuola media "Archimede"), mantenendo tale vocazione anche quando, il 1° ottobre del 1970, viene nominato parroco di Godrano, un piccolo paese della provincia di Palermo costretto, in quegli anni, a far fronte agli scontri feroci in corso tra due famiglie mafiose: famiglie che, anche grazie all'opera di evangelizzazione di Don Puglisi, si riconciliano. Continua a insegnare fino al 1972 alla scuola media "Archimede", e nel frattempo è docente anche alla scuola media di Villafrati.
Nel 1975 è professore alla sezione di Godrano della scuola media di Villafrati, e dall'anno successivo anche all'istituto magistrale "Santa Macrina". Dal 1978, anno in cui comincia a insegnare al liceo classico "Vittorio Emanuele II", lascia la parrocchia di Godrano e diventa pro-rettore del seminario minore di Palermo; successivamente assume l'incarico di direttore del Centro diocesano vocazioni, per poi accettare il ruolo di responsabile del Centro regionale vocazioni.
Nel frattempo, è membro del Consiglio nazionale e contribuisce alle attività della Fuci e dell'Azione Cattolica. A partire dal mese di maggio del 1990 svolge il proprio ministero sacerdotale anche a Boccadifalco, alla Casa Madonna dell'Accoglienza dell'Opera Pia Cardinale Ruffini, aiutando ragazze madri e giovani donne in situazioni di difficoltà. Il 29 settembre dello stesso anno Don Pino Puglisi viene nominato parroco a San Gaetano, tornando quindi a Brancaccio, il suo quartiere di origine: un quartiere gestito dalla mafia - e in particolare dai fratelli Gaviano, boss strettamente legati alla famiglia di Leoluca Bagarella.
In questo periodo, quindi, comincia la lotta di Don Puglisi contro la criminalità organizzata: non tanto cercando di riportare sulla retta via chi è già mafioso, ma provando a evitare che si facciano coinvolgere dalla criminalità i bambini che vivono per le strade e che ritengono che i mafiosi siano delle autorità e delle persone degne di rispetto. Nel corso delle sue omelie, comunque, Don Pino si rivolge frequentemente ai mafiosi, dimostrando di non temere (almeno pubblicamente) eventuali conseguenze. Grazie alla sua attività e ai giochi che organizza, il parroco siciliano toglie dalla strada numerosi bambini e ragazzi che, senza la sua presenza, sarebbero stati sfruttati per spacciare o per compiere rapine, coinvolti in maniera irreparabile nella vita criminale.
Per questa sua attività, a Don Puglisi vengono rivolte e recapitate numerose minacce di morte da parte di boss mafiosi, di cui tuttavia non parla mai a nessuno. Nel 1992 riceve l'incarico di direttore spirituale del seminario arcivescovile di Palermo, e pochi mesi più tardi inaugura il centro Padre Nostro a Brancaccio, finalizzato all'evangelizzazione e alla promozione umana.
Il 15 settembre del 1993, in occasione del suo cinquantaseiesimo compleanno, Don Pino Puglisi viene ucciso poco prima delle undici di sera in piazza Anita Garibaldi, davanti al portone di casa sua, nella zona orientale di Palermo. Dopo essere sceso dalla sua auto, una Fiat Uno, viene avvicinato al portone da un uomo che gli spara contro alcuni colpi diretti alla nuca. Le ultime parole di Don Pino sono "Me lo aspettavo", accompagnate da un tragico sorriso.
L'assassino è Salvatore Grigoli (autore di più di quaranta omicidi, come egli stesso confesserà), presente insieme con Gaspare Spatuzza e altre tre persone: un vero e proprio commando composto anche da Luigi Giacalone, Cosimo Lo Nigro e Nino Mangano. I mandanti dell'omicidio sono, invece, i capimafia Giuseppe e Filippo Gaviano (che per l'assassinio verranno condannati all'ergastolo nel 1999).
I funerali del parroco si svolgono il 17 settembre: il suo corpo viene sepolto nel cimitero palermitano di Sant'Orsola, e sulla tomba saranno riportate le parole "Nessuno ha un amore più grande di questo: dare la vita per i propri amici", tratte dal Vangelo di Giovanni.