Gregorio Magno nasce nel 540 circa a Roma, figlio di Gordiano e di Santa Silvia, erede della famiglia senatoriale degli Anicii. Dopo avere studiato diritto e grammatica, ricopre la carica di prefetto della città di Roma (praefectus urbi Romae), ruolo che segna il suo esordio nella vita pubblica.
Ammiratore di Benedetto da Norcia, di cui è anche biografo, impegna molte delle proprie risorse per trasformare in monasteri le sue proprietà in Sicilia e a Roma, oltre che per aiutare i poveri. Dopo avere rinunciato alla carica di prefetto, decide di farsi monaco, intraprendendo la vita cenobitica e spendendo molto tempo nella lettura della Bibbia.
Dimora per qualche tempo nel suo convento del Celio, ma ben presto è costretto a lasciarlo: una volta ordinato diacono, infatti, intorno al 579 viene inviato da Papa Pelagio II come apocrisario alla corte di Costantinopoli, allo scopo di chiedere sostegno per combattere i Longobardi. Rimane a Costantinopoli per sei anni, e qui si guadagna la stima di Maurizio I, l'imperatore salito al trono nel 582, al punto che viene scelto per battezzare suo figlio Teodosio.
Tornato a Roma nel 586, rientra nel monastero del Celio, ma anche in questo caso la sua permanenza dura pochi anni. Il 7 febbraio del 590, infatti, Papa Pelagio II muore per colpa della peste, e Gregorio Magno viene chiamato al soglio pontificio, complice il sostegno del senato romano e del clero. Egli, tuttavia, prova a opporsi e a resistere alle insistenze del popolo, chiedendo all'imperatore Maurizio di non ratificare l'elezione tramite una lettera che, tuttavia, viene intercettata e sostituita da una petizione del popolo a sostegno della sua nomina papale.
La situazione rimane in stallo per diversi mesi, e ad agosto Gregorio invita alla penitenza i fedeli, organizzando anche una processione presso la basilica di Santa Maria Maggiore. Nel corso della processione, ha la visione dell'Arcangelo Michele che rinfodera la sua spada in cima alla Mole Adriana, e interpreta questo simbolo come un segno del cielo che anticipa la fine dell'epidemia di peste che imperversa ormai da mesi.
Poco dopo, da Costantinopoli giunge la ratifica all'elezione papale, a dispetto delle reticenze di Gregorio, il quale, dunque, il 3 settembre del 590 viene consacrato Papa Gregorio I. Egli rimane molto turbato da questa ascesa al soglio pontificio, che per molti versi appare quasi come obbligata e lo contraria: riesce, comunque, a superare il momento di difficoltà grazie alla sua fede e al desiderio di guidare la redenzione umana.
Nel corso del pontificato, egli si rivela un amministratore energico non solo dal punto di vista delle questioni ecclesiastiche interne, ma anche per quel che riguarda i temi politici e sociali. Si dimostra, quindi, un uomo di azione, a dispetto della sua salute tutt'altro che forte, imponendosi la moralizzazione della Curia romana. Sul piano politico, cerca in più occasioni l'aiuto militare dell'impero, per tentare di contrastare le devastazioni compiute dai Longobardi, che hanno l'effetto di far scappare il clero. L'esarca di Ravenna, tuttavia, non fornisce alcun aiuto, e anzi tenta di ostacolarlo: le trattative intavolate da Gregorio Magno con il duca di Spoleto finalizzate a ottenere una pace separata vengono interrotte, così come quelle intraprese dal pontefice direttamente con i Longobardi.
A causa di un esercito imperiale tutt'altro che efficiente, anche perché pagato male, Papa Gregorio I si trova a dover organizzare in prima persona la difesa di Roma, e paga 5mila libbre d'oro di tasca propria ad Agilulfo per indurlo a levare l'assedio, assicurandogli al tempo stesso il pagamento di un notevole tributo ogni anno.
Così, in maniera del tutto arbitraria il pontefice si sostituisce al senato e all'autorità civile cittadina, privi ormai di qualsiasi tipo di ruolo politico, riuscendo a salvare il popolo romano. Egli, però, viene accusato di infedeltà dall'imperatore Maurizio, che disapprova il suo comportamento e lo accusa di avere cercato di negoziare con il nemico in maniera poco intelligente.
In realtà, in qualità di vescovo di Roma, Gregorio I ritiene che i propri beni e quelli ricavati dalle donazioni dai privati debbano essere messi a disposizione non dei diaconi e dei vescovi, ma del popolo romano.Nel frattempo, egli si attiva anche per regolamentare i rapporti dell'istituzione monastica con i vescovi, garantendo un'autonomia giuridica maggiore per i monasteri, che in nessun modo avrebbero dovuto avere a che fare con le ingerenze ecclesiastiche, e disciplinando i rapporti tra la vita familiare e la scelta monacale. Avendo come punto di riferimento questa visione della missione della Chiesa, cerca di evangelizzare non solo i Visigoti di Spagna, guidati da re Recaredo I, ma anche, per l'appunto, i Longobardi: e in effetti con questi stabilisce, in seguito alla pace del 598, dei rapporti positivi, dando il la alla loro conversione, anche in virtù dell'impegno della regina Teodolinda.
Lo stesso sforzo missionario viene messo in pratica anche verso i Britanni: in questo caso, Gregorio spedisce dei monaci benedettini allo scopo di cristianizzare le popolazioni, e ottiene in breve tempo la conversione della Britannia, anche con l'aiuto della regina Brunechilde (i rapporti con i Franchi erano ottimi), affidandola al priore del convento di Sant'Andrea Agostino, che poi verrà consacrato vescovo di Canterbury.Se le relazioni con i Franchi sono ottime, lo stesso non si può dire per i rapporti con l'imperatore Maurizio, al di là della questione longobarda: tra i motivi di attrito tra i due si ricorda l'editto promulgato dall'imperatore che proibisce ai soldati privati e ai funzionari pubblici di diventare monaci (una decisione assunta per arrestare la fuga dei decurioni).
Dopo avere promosso il canto liturgico che da lui prenderà il nome di canto gregoriano, Papa Gregorio I - ricordato storicamente come Gregorio Magno - muore a Roma il 12 marzo del 604: il suo corpo viene sepolto nella Basilica di San Pietro.